Optimización de la producción de proteína antifúngica PeAFpA en la biofactoría Penicillium chrysogenum

Abstract

Las proteínas antifúngicas de origen fúngico (AFPs) representan una alternativa prometedora frente a las infecciones fúngicas en salud, agricultura y postcosecha. Entre ellas, PeAfpA, producida de forma natural por Penicillium expansum, destaca por su elevada actividad antifúngica y su amplio espectro de acción. Sin embargo, el uso de P. expansum como biofactoría presenta importantes limitaciones, ya que se trata de una especie fitopatógena y productora de micotoxinas. Por ello, su producción heteróloga se ha trasladado a Penicillium chrysogenum, un hospedador más seguro y con interés biotecnológico por su elevada capacidad secretora. En este contexto, el presente trabajo tuvo como objetivo evaluar si la modificación de genes de quitina sintasa podía constituir una estrategia útil para optimizar la capacidad productora de una cepa de P. chrysogenum diseñada previamente para la producción de PeAfpA. Las quitina sintasas son enzimas responsables de la síntesis de quitina, uno de los principales componentes estructurales de la pared celular fúngica. La elección de los genes csmA y chsF se basó en un estudio realizado en Aspergillus niger, donde su alteración se asoció con un aumento de la secreción de proteínas extracelulares. Para ello, se identificaron en P. chrysogenum las secuencias homólogas de csmA y chsF descritas en A. niger, se diseñaron guías CRISPR/Cas9 frente a ambos genes y se construyeron los vectores correspondientes. Posteriormente, se generaron transformantes mediante transformación de protoplastos y se verificaron molecularmente mediante PCR y secuenciación. Los resultados permitieron confirmar la obtención de mutantes en el locus chsF, mientras que en el caso de csmA no se obtuvieron mutantes confirmados en las muestras analizadas. La caracterización fenotípica mostró que las cepas mutantes presentaron, en general, un crecimiento comparable al de la cepa control WT PCSO12112, sin alteraciones severas en las condiciones ensayadas, y aunque algunas colonias mostraron una coloración blanquecina, este rasgo no pudo considerarse un marcador fiable de edición. La evaluación de la producción proteica se centró en el mutante chsF 5.2. En PcMM, la producción total de proteínas fue comparable a la de la cepa control; en YPD se observaron cambios en la cinética de secreción, pero sin diferencias significativas entre ambas cepas; y en CM los resultados fueron variables y no permitieron extraer conclusiones firmes. En cuanto a la producción específica de PeAfpA, los datos fueron limitados y, en varios casos, solo pudieron interpretarse de forma descriptiva debido a la pérdida de réplicas biológicas. En conjunto, estos resultados sugieren que la mutación de chsF no produce un efecto fenotípico severo ni una mejora clara y reproducible en la producción de PeAfpA. Estos resultados demuestran la viabilidad técnica de la edición dirigida de genes de quitina sintasa en P. chrysogenum mediante CRISPR/Cas9 y aportan una primera aproximación al posible efecto de la mutación en chsF sobre la capacidad productiva de esta biofactoría. No obstante, será necesario ampliar el análisis con más mutantes y un mayor número de réplicas biológicas para determinar con mayor solidez el potencial biotecnológico de esta estrategia.