Diseño y expresión de un biosensor de la actividad de pka ciliar en modelos celulares del síndrome de ellis van creveld

Abstract

Los cilios son estructuras de gran importancia a nivel celular, pues funcionan como antenas que recogen información del ambiente, donde en su interior, se encuentran diversas señalizaciones que son de gran importancia, como la vía de señalización Hedgehog. Su principal funcionalidad se centra en el correcto funcionamiento de los genes GLI, importantes para la correcta formación del sistema nervioso en la etapa embrionaria. La ciliopatía Ellis van Creveld es provocada por fallos en el complejo proteico EVC/EVC2, cuya consecuencia es la transformación de genes GLI a su forma represiva GLIR por acción de la quinasa PKA. En este estudio queremos generar un biosensor por clonación molecular para poder comprobar la función de PKA en fibroblastos embrionarios de ratón que son knockout (KO) para el complejo EVC/EVC2. Se buscará la construcción de dos sensores, ciliar y de membrana plasmática, tanto para medir la acción de PKA en el cilio como para obtener un control, respectivamente. Este sensor constará de tres partes fundamentales: Proteína que conduce al cilio (Arl13b) o a la membrana plasmática (Fyn, como control), unión a anticuerpo para la detección (EFGV), y un sustrato específico de PKA (proteína VASP). Tras evaluar su expresión transitoria a través de ensayo de inmunofluorescencia, esta se muestra correcta y viable en células, al menos de forma transitoria, por lo que el biosensor podría empezar a utilizarse en ensayos in vitro.